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液相色譜儀硅膠色譜柱清洗方法與技巧

點擊次數(shù):2878  更新時間:2015-12-09

液相色譜儀檢測分析過程中,硅膠色譜柱上被吸附的樣品成分累積到一定程度時,就開始形成新的固定相。新的檢測物質(zhì)能與殘留雜質(zhì)作用形成一定的分離機(jī)理,從而導(dǎo)致保留時間波動,出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。隨著時間的積累,色譜柱的反壓就會超過泵所能承受的zui大壓力,使色譜柱無法工作以及在堵塞處產(chǎn)生空體積。
    再生被污染的液相色譜柱的關(guān)鍵是了解污染物的性質(zhì)并且找到適當(dāng)?shù)娜軇﹣砬宄?。如果污染是因為重?fù)進(jìn)樣時強保留物質(zhì)的累積引起的,可用90~100%較強的溶劑沖洗20個體積可以清除污染物。例如,柱子中殘留的脂質(zhì)就能用非水溶劑如甲醇、乙晴、四氫呋喃。如果使用的是緩沖液系統(tǒng),不要直接切換到強溶劑,突然轉(zhuǎn)換到高濃度有機(jī)溶劑可能會使HPLC流動體系中的緩沖液沉淀,這樣會導(dǎo)致更大的問題如柱頭堵塞、管道堵塞、泵泄漏、活塞損傷或進(jìn)樣閥轉(zhuǎn)軸失靈。應(yīng)該先用無緩沖流動相(即把緩沖液換成水)沖洗5~10個體積以后才更換強溶劑。
    有時候,強溶劑也沒法把殘留在色譜柱上的污染物洗掉。那么就需要使用更強的溶劑或者多重溶劑來清洗柱子。一般來說,所有的清洗方法都有類似的形式。所用的溶劑都是隨溶劑強度增加,經(jīng)常zui后一個溶劑是非常疏水的(如醋酸乙酯),可以用來溶解非極性物質(zhì)如脂質(zhì)和油類。在使用多重溶劑時,須保證每個溶劑都能與下一個溶劑互混。清洗過程要結(jié)束時,必須借助一個中等強度能互混的溶劑而回到原始溶劑系統(tǒng)。例如,異丙醇是一個非常好的作為中間步驟的溶劑,因為它能與正己烷或二氯甲烷互溶又能與水相溶劑互溶。但是異丙醇粘度非常大,必須確保較低的流速以免使泵壓過高。當(dāng)然,如果使用紫外檢測器的話,避免溶劑在紫外區(qū)域有吸收,要不然需使用大量的溶劑沖洗才能使基線平穩(wěn)。
硅膠鍵合柱常用的緩沖溶液可使用以下溶劑:100%甲醇、100%乙腈、75%乙腈-25%異丙醇、100%異丙醇、100%二氯甲烷、100%正己烷。用二氯甲烷或正己烷以后,由于溶劑相容性柱子必須用異丙醇沖洗后才能用原來的水相溶劑,每種溶劑至少沖洗10個柱體積。如250mm×4.6mmHPLC分析柱,可以用1~2ml/min的流速來沖洗,要回復(fù)原來的溶劑體系,不需要每一步都沖洗,可以跳過中間步驟。中間步驟可使用異丙醇,然后用沒有緩沖的流動相,zui后回復(fù)起始流動相配置。四氫呋喃是另外一種教常用的去除污染的溶劑。如果色譜柱被嚴(yán)重污染,可以二甲基亞砜或者二甲基甲酰銨和水按50:50的比例混合用低于0.5ml/min的流速流過色譜柱。成功再生反相柱子是一個非常耗時間的過程,溶劑沖洗可以利用梯度洗脫系統(tǒng)操作;還有一個問題是清洗過程中是否可以反沖HPLC色譜柱,因為大多數(shù)強保留的污染物都會累積在柱頭,把柱子反過來可以縮短污染物被沖出柱子的移動距離??紤]到裝填柱子的穩(wěn)定性,現(xiàn)在大多數(shù)HPLC柱子都是比普通操作壓力大很多的高壓裝填的,因此他們的柱床應(yīng)該不會受到反方向流速的影響。但是,如果頭上的燒結(jié)比尾部的燒結(jié)孔徑大的話。例如尾部燒結(jié)的孔徑是2μm,通常能夠留住平均5μm孔徑里的填料。如果這種孔徑大于裝填顆粒尺寸分布曲線的zui小粒徑時,有些填料能穿過這些縫隙而流出色譜柱,這樣會導(dǎo)致空白出現(xiàn)。
清洗色譜柱的頻率主要看有多少強保留物質(zhì)流經(jīng)色譜柱,因為反相柱有時候在分辨率消失或者鬼峰出現(xiàn)前能承受很大的污染,使用者經(jīng)常會等到出現(xiàn)了異常情況才開始注意。然而,污染物過多的累積會導(dǎo)致清洗柱子的難度加大。所以,經(jīng)常用雜質(zhì)較多的樣品上樣時,應(yīng)當(dāng)有規(guī)律地清洗柱子。

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